Leishmaniosis

Coordinador: Jose María Requena Rolanía UAM-B

promastigotes leishmaniaLas leishmaniosis son una serie de enfermedades causadas por distintas especies del género Leishmania. De las distintas formas clínicas de la enfermedad, la leishmaniosis visceral es la más grave y suele resultar fatal si no es diagnosticada y tratada a tiempo.

Las leishmaniosis son endémicas en 88 países de África, Asia, Europa, Sudamérica y Norteamérica. Se estima en 12-14 millones el número de personas que actualmente están afectadas de estas parasitosis, produciéndose anualmente 1,5-2 millones de casos nuevos. Además, los datos indican que existe una tendencia a aumentar la incidencia de estas enfermedades debido a factores de riesgo como son las infecciones por HIV, la malnutrición y las migraciones masivas. Actualmente no existe ningún método profiláctico eficaz y los tratamientos quimioterapéuticos no poseen la eficacia deseable.

En España y otros países de la cuenca mediterránea, la especie predominante es L. infantum, cuya infección produce principalmente afecciones viscerales. Además de en los países ribereños del Mediterráneo, esta especie se encuentra extendida en África Occidental, América, norte de China y oeste asiático. Su principal huésped es el perro, que actúa como reservorio para la transmisión a humanos. Además, desde la aparición y expansión del SIDA, se ha producido un rebrote de la incidencia de leishmaniosis en humanos, dado que se ha mostrado que L. infantum es el principal parásito oportunista en estos pacientes.

Junto a la gran información que se está acumulando procedente del conocimiento de la secuencia del genoma de varias especies de Leishmania, en los últimos años también se han desarrollado otras herramientas moleculares que están permitiendo un avance rápido en la comprensión de muchos aspectos únicos de la biología molecular y celular de estos organismos. Entre éstas, cabe destacar las técnicas proteómicas, que permiten realizar análisis a gran escala de proteínas expresadas en un momento particular del ciclo de vida de un determinado organismo. Así, la combinación de electroforesis bidimensional junto a la espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta magnífica para determinar cambios en la expresión de proteínas y su rápida identificación.

En consecuencia, las perspectivas de controlar estas enfermedades pasan por desarrollar nuevas aproximaciones de investigación encaminadas a aumentar el conocimiento sobre la biología molecular de este parásito, que permitirá identificar nuevos blancos para el diagnóstico, el tratamiento y el desarrollo de vacunas.

Subprograma: Epidemiología Molecular, Diagnóstico y Control

Coordinador: Jose María Requena Rolanía UAM-B

El status taxonómico de las especies de Leishmania causantes de leishmaniasis visceral (LV) en el Este de África es un tema controvertido. En un principio, se asoció L. donovani, causante de LV y leishmaniasis dérmica post Kala-azar (LDPK), fundamentalmente a un ciclo antroponótico y L. infantum, causante de leishmaniasis cutánea (LC) y LV, a un ciclo zoonótico. Sin embargo, los recientes hallazgos de cepas de L. donovani en perros en Sudán junto con las nuevas revisiones de la filogenia del complejo donovani, obligan a replantearse estos conceptos. El control de la enfermedad variaría sustancialmente si nos encontramos ante una antroponosis o una zoonosis. Por ello, más allá del conflicto L. donovani/L. infantum, para un mayor conocimiento de la epidemiología de la LV en el cuerno de África, se hace necesario disponer de marcadores que permitan el conocimiento de las cepas circulantes en los distintos ciclos epidemiológicos, su distribución/dispersión geográfica, el estudio de focos y brotes, así como establecer qué pacientes desarrollarán LDPK.

Objetivos:

1. Análisis de la variabilidad genética de aislados procedentes de Sudán y Etiopía de L. infantum/L. donovani.

2. Obtención de marcadores epidemiológicos para el estudio de brotes e identificación de ciclos

3. Obtención de marcadores de evolución de leishmaniasis visceral a leishmaniasis dérmica post Kala-azar

4. Proporcionar a la OMS una herramienta para el control de la leishmaniasis en el Cuerno de África

 

Aproximación Genómica para el desarrollo de métodos de diagnóstico y control de las leishmaniosis 

IP: José María Requena. UAM-B

 

A pesar de la gran incidencia que las leishmaniosis tienen en la población humana mundial, actualmente no existe ninguna vacuna frente a estas parasitosis y los tratamientos quimioterapéuticos carecen de la eficacia deseable. Además, la aparición de cepas resistentes a los fármacos actualmente empleados comienza a ser un grave problema. En la anterior Red de Investigación de Centros de Enfermedades Tropicales (RICET) se llevó a cabo la construcción de ordenamientos genómicos en membranas ("macroarrays") de L. infantum, mostrándose como herramientas muy útiles para analizar diversos aspectos de la biología de este parásito, que pueden ser explotados para el desarrollo de herramientas de diagnóstico y control de las leishmaniosis. Además, la reciente secuenciación del genoma de Leishmania ha generado una inmensa cantidad de información que es un buen complemento para la aproximación Genómica que se pretende seguir en este proyecto.

Objetivos:

1. La generación de membranas de ordenamientos genómicos de L. infantum en cantidad suficiente para su utilización por los diferentes Grupos.

2. Utilizar los ordenamientos genómicos para desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico que permitan determinar: grado de virulencia de cepas, diferencias en el tropismo del parásito en el huésped y resistencia a fármacos.

3. Analizar: genes implicados en el metabolismo del folato como blancos para el desarrollo de nuevas drogas, cambios en la expresión génica inducidos por el tratamiento con nuevas sustancias leishmanicidas, alteraciones en la expresión génica ocasionados por péptidos leishmanicidas, efecto sobre la expresión génica inducida tras la introducción en Leishmania del retrotransposón heterólogo L1Tc y la implicación de determinados grupos de genes en la diferenciación promastigote-amastigote en L. Infantum.

 

Aplicaciones del modelo de infección experimental al control de la leishmaniasis canina.

IP: Javier Moreno, CIB-CSIC

 

El perro constituye el principal reservorio de L. infantum y juega un papel clave en la transmisión al humano, es por ello que el control efectivo de la leishmaniasis visceral zoonótica requiere el control efectivo de la infección en el perro. El establecimiento de medidas de control eficaces contra la leishmaniasis canina, con impacto en la incidencia en humana, requiere el desarrollo de nuevas aproximaciones diagnósticas, terapéuticas y profilácticas y su ensayo en el modelo canino.

La caracterización en el modelo canino de la respuesta inmune frente a diferentes proteínas recombinantes de L. infantum permite determinar su capacidad inmunogénica y establecer su utilidad para el diagnóstico, la protección o papel inmunomodulador en la infección por L. infantum.

Objetivos:

1. Aislamiento y purificación a homogeneidad de proteínas recombinates de Leishmania.

2. Caracterización de la respuesta humoral frente a moléculas recombinantes de Leishmania infantum. Utilidad para el inmunodiagnóstico de la infección y su valor pronóstico en perros natural y experimentalmente infectados.

3. Análisis de la respuesta celular inducida por las moléculas recombinantes de L. infantum mediante ensayos de linfoproliferación in vitro. Determinación del perfil de citoquinas inducidas por las proteínas recombinantes. 

4. Estudio de la capacidad inmunomoduladora de las moléculas recombinantes de L. infantum. Efectos sobre la inmunidad innata

Subprograma: Terapéutica Anti-Leishmania

Coordinador: Francisco Gamarro Conde IPBLN-C

Dentro de la iniciativa de un proyecto coordinado, la presente propuesta pretende establecer y caracterizar el mecanismo de acción de algunos de estos compuestos, caracterizar los mecanismos de resistencia que Leishmania desarrolla frente a los fármacos leishmanicidas y péptidos antibióticos más prometedores así como estudiar marcadores epidemiológicos, de tropismo y virulencia en la leishmaniasis. Todo lo cual, conducirá hacia un diseño de nuevos fármacos, a disponer de marcadores de resistencia a fármacos, de tropismo y virulencia que en definitiva facilitará el control de esta enfermedad parasitaria. El tratamiento de la leishmaniasis con complejos de antimonio pentavalente es tóxico y se enfrenta a la cada vez más frecuente aparición de resistencias. La terapia alternativa con formulaciones de anfotericina B es tóxica y costosa. El problema se agrava debido a un incremento progresivo de coinfecciones con HIV en cuyo caso el tratamiento no es eficaz. Recientemente se ha aprobado en la India un tratamiento por vía oral con el alquil-fosfolípido miltefosina (hexadecilfosfocolina) que muestra una gran eficacia y podría ser empleado en pacientes coinfectados con HIV. Leishmania, al igual que otros organismos, puede desarrollar procesos de resistencia a fármacos debido principalmente a la sobreexpresión o mutación de la proteína blanco de acción del fármaco, o a la reducción del acúmulo del fármaco debido a la expresión de proteínas transportadoras ABC que actúan como bombas de eflujo. El estudio de los patrones proteómicos de los parásitos sometidos a la presencia de nuevos y potenciales fármacos leishmanicidas o de líneas resistentes, permitirá identificar las posibles dianas terapéuticas así como los mecanismos por los cuales los parásitos pueden llegar a ser resistentes. Igualmente este análisis permitirá seleccionar factores de virulencia y tropismo a partir del estudio proteómico de promastigotes de L. infantum pertenecientes a zimodemas dermotrópicos, viscerotrópicos y aislados de pacientes coinfectados con VIH y aislados de leishmaniasis caninas. Esto conducirá en un futuro al diseño racional de nuevos fármacos así como al empleo de estrategias alternativas de tratamiento en casos de la aparición de resistencias y de control de la enfermedad.

Objetivo:

El objetivo principal del proyecto es la identificación en el parásito Leishmania de nuevas dianas terapéuticas, conocer los mecanismos de resistencia a fármacos leishmanicidas y nuevos péptidos antibióticos, así como determinar los factores de virulencia y tropismo mediante la aplicación de la proteómica.

 

Nuevas alternativas en quimioterapia de Leishmania

IP:  Luis Rivas, CIB-CSIC

 

La quimioterapia de Leishmania es, actualmente, el único medio de tratamiento contra la misma;  sin embargo se enfrenta a la alta frecuencia de efectos citotóxicos inherentes a la mayoría de los fármacos leishmanicidas, excepto anfotericina B liposomal y miltefosina, e incidencia creciente de resistencias. La consecuencia final es la necesidad del desarrollo de nuevos fármacos con i).-alto índice terapéutico, ii).-posibilidad de producción a bajo coste, iii).-baja inducción de resistencias, iv) que exploten nuevas dianas; v).-Idealmente, con actividad adicional sobre otros parásitos, aparte de Leishmania.

Dentro del proyecto cooperativo de la RICET  se abordarán posibles alternativas a dichos problemas conforme a i).-Disponibilidad de bancos de productos naturales con actividades no ensayadas; ii) Capacidad sintética para desarrollo y/o modificación de fármacos, así como existencia de un quimiobanco iii).- Desarrollo de péptidos antimicrobianos de origen eucariótico (PAEs) activos en membrana, derivados de componentes de la inmunidad innata, estos péptidos, altamente catiónicos y capacidad de adopción de estructuras anfipáticas. Explotan como nuevo mecanismo de acción la desestructuración de la membrana plasmática del patógeno, por interacción estequiométrica y preferencial con fosfolípidos aniónicos expuestos en la cara externa de la membrana plasmática, característica  común a procariotas y eucariotas inferiores (protozoos, hongos), pero no a superiores, con disipación de gradientes iónicos y muerte del parásito. Conforme a dicho mecanismo, la inducción de resistencias es improbable, al requerir cambio drástico en la composición de fosfolípidos que afecta simultáneamente a todos los sistemas enzimáticos y de transporte ubicados en la misma.

Para lograr un screening tanto de fármacos como de dianas lo más eficaz posible, proponemos el desarrollo de una colección de cepas de Leishmania con expresión génica alterada la expresión de genes diana o codificantes para etapas limitantes de rutas metabólicas y de transducción de señales, que permita una definición general de las dianas implicadas para un determinado fármaco, o viceversa, focalizar la obtención de fármacos para una diana determinada.

La disponibilidad actual de moléculas líderes leishmanicidas, con acción contrastada in vitro e in vivo y la obtención de nuevos agentes de diseño y síntesis permitirá, por otro lado, su ensayo en otros parásitos objeto de otros proyectos de la red. Recíprocamente, este proyecto se beneficiará del desarrollo de compuestos bioactivos desarrollados en la red para otros patógenos, particularmente tripanosomátidos. Como ejemplo, se puede citar que el desarrollo original de anfotericina B y miltefosina fue  como agentes antifúngico y antineoplásico, respectivamente.

Objetivos:

1.- Screening de nuevos compuestos activos en Leishmania.

2.- Desarrollo de péptidos antibióticos leishmanicidas activos en membrana, tanto de diseño como de secuencias de péptidos naturales.

3.- Desarrollo de una colección de parásitos de Leishmania con expresión alterada de genes diana de fármacos  

 

Inmunomoduladores en la terapia de leishmaniasis.

IP: Basilio Valladares, IUETSPC 

 

El tratamiento de la Leishmaniasis es un tema por resolver. En la actualidad, y desde mediados del siglo pasado se usan drogas que requieren administración parenteral y prolongados tratamientos, presentando además, una serie de reacciones adversas que dificultan su utilización (cardiotoxicidad con electrocardiogramas anormales, pancreatitis, etc.). Existen principios activos de origen vegetal y sintéticos con actividad leishmanicida prometedora y baja toxicidad, (péptidos, moléculas orgánicas de síntesis etc), pero hasta ahora por si solos, no son capaces eliminar totalmente al parásito. Por otro lado, se sabe que la modulación del sistema inmune hacia una respuesta celular de tipo TH1 favorece la muerte de estos protozoos. Así mismo, la estimulación de óxido nítrico ayuda a la muerte del protozoo.

Pretendemos utilizar los principios activos de probada actividad leishmanicida que se han identificado en distintos laboratorios, en conjunción con proteínas de Leishmania sp.  de las que se ha demostrado  que en forma de proteínas recombinantes inducen respuesta inmunológica tipo Th1.  La suma de las dos acciones podría eliminar al parásito provocando la curación del hospedador.

Objetivos:

1. Expresión y purificación de las proteínas recombinantes obtenidas de Leishmania sp. y que hayan demostrado inmunomodulación con inducción  de una respuesta TH1 y producción de oxido nítrico.

2. Búsqueda, aislamiento, purificación y síntesis de las moléculas que hayan demostrado actividad leishmanicida in vitro .

3. Evaluación de la actividad leishmanicida en animales de experimentación de la administración conjunta de inmunomoduladores y sustancias químicas obtenidas en los apartados anteriores.

4. Búsqueda, aislamiento, expresión,  purificación y estudio de nuevas moléculas con actividad inmunomuduladora.

Subprograma: Desarrollo de Moléculas Candidatas a Vacunas

Coordinador: Manuel Carlos López López IPBLN-A

El control de la leishmaniosis requerirá de la inducción de una respuesta inmune múltiple que integre activación celular y producción de anticuerpos con un cierto balance hacia una respuesta de tipo 1, de diferente intensidad dependiendo de la especie de Leishmania y tipo de leishmaniosis que origina. Se postula que las moléculas capaces de inducir protección frente a la infección por dicho parásito, deberá portar distintos componentes antigénicos del parásito, debidamente seleccionados por su capacidad inmune, así como inmunomoduladores capaces de potenciar y/o dirigir la respuesta inmune del hospedador hacia un perfil específico protectivo. Así, la caracterización inmunológica y análisis de la capacidad protectora frente a la infección por Leishmania, de determinadas proteínas antigénicas del parásito o fragmentos de las mismas, asociados a inmunomoduladores y en el contexto de moléculas de DNA) y/o proteína recombinantes quiméricas, será esencial para la obtención de moléculas capaces de combatir y/o prevenir la referida infección parasitaria.

Objetivo: 
Se pretende el diseño y obtención de moléculas quiméricas portando antígenos del parásito Leishmania  y el estudio, en sistemas de experimentación murino (ratones de diferente haplotipo y susceptibilidad a la leishmaniosis visceral y cutánea y hámster), de su inmunogenicidad y capacidad de inducir protección frente a la infección por dicho parásito.

 
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